Dafoe, deneysel tiyatro şirketi the Wooster Group'un erken bir üyesiydi ve burada çeşitli prodüksiyonlarda rol aldı. İlk filmini Heaven's Gate (1980) filminde yaptı, ancak yapım sırasında kovuldu. İlk başrolünü outlaw biker filmi The Loveless (1982) 'de oynadı ve daha sonra streets of Fire (1984) ve to Live and Die in L. A. (1985)' de ana antagonisti oynadı. Oliver Stone'un savaş filmi Platoon'da (1986) Çavuş Elias Grodin rolüyle ilk Akademi Ödülü'ne aday gösterildi. 1988'de Dafoe, Martin Scorsese'nin The Last Temptation of Christ filminde İsa'yı canlandırdı ve her ikisi de tartışmalı olan Mississippi Burning filminde rol aldı. Born on the Fourth of July (1989) ve Wild at Heart (1990) filmlerinde küçük rollerin ardından, yönetmen Paul Schrader ile Drama Light Sleeper (1992) ile altı filmlik bir işbirliğine başladı. Eleştirmenlerce beğenilen Erotik gerilim filmi body of Evidence (1993) filminde rol aldı ve daha sonra Clear and Present Danger (1994), the English Patient (1996), Speed 2: Cruise Control (1997) ve The Boondock Saints (1999) filmlerinde rol aldı.
Vampirin gölgesi (2000) filminde Max Schreck'i canlandırdığı için ikinci Akademi Ödülü'ne aday gösterildikten sonra Dafoe, süper kahraman filmi Spider-Man (2002), Meksika'da bir zamanlar kötü adamlar (2003) ve XXX: Union State (2005) ve Bay Bean's Holiday (2007) filminde Carson Clay'i canlandırdı. 2009 yılında, Lars von Trier ile yaptığı üç filmden biri olan deneysel Deccal filminde rol aldı. Dafoe daha sonra Yıldızlarımızda, John Wick, büyük Budapeşte oteli (tüm 2014), Çin Seddi (2016), Orient Express'te cinayet (2017), Florida Projesi (2017), üçüncü Akademi Ödülü adaylığını aldığı Aquaman (2018) ve Deniz Feneri (2019). Ayrıca Finding Nemo (2003), devamı Finding Dory (2016) ve Fantastic Mr. Fox (2009), John Carter (2012) ve Death Note (2017) ses ve hareket yakalama rolleri ve video oyunları Spider-Man (2002), Finding Nemo (2003), James Bond 007: Everything or Nothing (2004) ve Beyond: Two Souls (2013) vokal katkıları.
Dafoe, Tom & Viv'deki T. S. Eliot (1994), Pasolini'deki Pier Paolo Pasolini (2014), Eternity Kapısı'ndaki Vincent van Gogh (2018) dahil olmak üzere birçok gerçek hayat figürünü canlandırdı. Dafoe, Amerika Birleşik Devletleri ve İtalya'nın çifte vatandaşlığına sahiptir.